全外顯子捕獲應用
應用背景
全外顯子測序（Whole Exome Sequencing, WES）僅對人基因組約 2% 的區域測序，便可覆蓋絕大多數基因的編碼序列和 > 99%（臨床基因組資源庫，ClinGen）的疾病相關區域。借助 WES 可檢測基因的點突變、小片段插入缺失、基因重排及拷貝數變異等信息。隨著測序成本的下降，其在基礎研究、遺傳病篩查、腫瘤分子診斷方面得到廣泛的應用。
方案推薦
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文庫構建 |
封阻序列 |
靶向捕獲 |
測序平臺 |
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NadPrep? NanoBlockers
(for Illumina?) |
Illumina? Systems |
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MGISEQ / DNBSEQ? |
相關產品僅限研究使用，不用于臨床診斷。
不同平臺捕獲表現
圖 1. Exome Plus Panel v2.0 在MGISEQ-2000 和 Illumina NovaSeq 6000平臺的捕獲表現。利用 NadPrep? 系列建庫試劑盒進行文庫構建，搭配Exome Plus Panel v2.0進行雜交。
不同 gDNA 文庫捕獲表現
圖 2. Exome Plus Panel v2.0 對不同gDNA文庫的捕獲表現。利用 NadPrep? 文庫構建試劑盒(for MGI)建庫，MGISEQ-2000(PE100)測序模式，利用BWA比對到參考基因組 GRCh37/hg19，按照reads數計算。 A. 捕獲數據比對率均>99%，捕獲效率>92%；B. 捕獲數據均可達到 >99% 的區域覆蓋>0.2x平均測序深度；C. 覆蓋均一性和一致性表現無顯著差異； D. 不同GC含量區域覆蓋無偏好性。
注：人類男性基因組DNA(Promega-male, G1471)；腫瘤結構變異5% gDNA標準品(菁良，GW-OGTM001)；腫瘤SNV 1-25% gDNA標準品(菁良，GW-OGTM004)；腫瘤SNV 野生型 gDNA 標準品(菁良，GW-OGTM005)。
WES捕獲的那些“雷區”
WES 分析中，文庫構建和靶向捕獲步驟中有不少潛在“雷區”需要注意，躲過這些“雷區”才可能獲得穩定可靠的 WES 測序數據。以下是較常見的問題和考慮。
起始樣本
樣本起始量與質量是靶向測序分析的基石。尤其是對于低頻突變的準確檢測，足夠的原始拷貝數是先決條件。為保證足夠的樣本文庫分子進入全外顯子捕獲測序分析，我們推薦參考表 1，并根據實際的樣本情況來確定起始量。
表1. 全外顯子靶向測序樣本要求
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要求 |
解決對策 |
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樣本質量 |
DNA 無嚴重降解 |
FFPE 樣本來源的 DNA 常有不同程度的降解，需先對片段完整性進行評估。低質量樣本可采用修復試劑進行處理。 |
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樣本純度 |
OD260 / OD280 = 1.8-2.0（無蛋白、RNA 污染）
OD260 / OD230 = 2-2.5（無有機物污染） |
使用蛋白酶 K 去除蛋白；RNA 酶去除 RNA；采用磁珠純化去除多余的鹽離子和有機物。 |
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樣本起始量 |
gDNA（無嚴重降解）
FFPE DNA（片段長度 ＞ 500 bp） |
gDNA ≥ 50 ng（取決于樣本質量）
FFPE DNA ≥ 100 ng（取決于樣本質量） |
接頭濃度
在接頭連接步驟，我們推薦根據 Input DNA 及片段大小確定接頭用量。針對外顯子捕獲的文庫構建，推薦 DNA 樣本片段化范圍為 150 ～ 350 bp。常見接頭濃度為 15 μM；當 Input DNA ≥ 500 ng 時，適度增加接頭用量可以提高文庫產出量；當 Input DNA ≤ 25 ng 時，接頭應稀釋后使用。
PCR擴增
我們建議根據樣本類型、片段化 Input DNA 和文庫預期產量調整 PCR 循環數，切忌文庫過度擴增。用于 WES 的 DNA 文庫，推薦通過循環數控制文庫產出至 600 ~ 1,000 ng，隨后單個文庫取 500 ng 進入雜交體系。外顯子捕獲測序的重要評價指標之一—重復率（Duplication rate），和擴增數有著直接關系：擴增數越多，因擴增產生的完全一致的文庫分子越多，測序數據重復率也相應增加，有效的測序數據量則被削減。
文庫的混雜
文庫的混雜是指多個樣本文庫混合進入單次捕獲實驗。相較于單個文庫捕獲，混雜后捕獲可有效提高生產速度、顯著節約成本?；祀s比（樣本進入雜交反應的文庫含量 / 該樣本的出庫總量）直接影響進入捕獲步驟的文庫豐度。過低的混雜比引入的測序數據的重復率（Duplication rate）較高，從而降低可用于分析的有效數據量。
此外，進行混合捕獲時，若期望多個文庫對應的測序數據量一致，則建議每個文庫等比混合；若根據不同的檢測目的，期望不同的數據量產出，則建議按比例混合進入雜交體系。
封閉非特異序列
在進行人類全外顯子捕獲時，應根據測序平臺和文庫類型使用對應的封阻序列（表 2）以及封閉基因組重復序列的 Human Cot-1 DNA。以上組分可以降低接頭間和重復序列間的非特異性結合，進而降低脫靶率，提升有效的捕獲數據比例。
表2. 不同測序平臺推薦的封阻序列
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測序平臺 |
封阻序列 |
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MGISEQ / DNBSEQ? |
NadPrep? NanoBlockers (for MGI) |
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Illumina? |
NadPrep? NanoBlockers (for Illumina?) |
精準控溫
在 NGS 雜交洗脫操作中，即使溫度發生了輕微改變，也會對外顯子捕獲的中靶率以及 GC 偏好性產生影響。測序數據中的 GC 偏好將直接影響捕獲數據的整體均一性。洗脫溫度的偏離，會導致極端 GC 含量區域捕獲的偏差或導致非特異性捕獲的增加。
捕獲后PCR
我們建議依據樣本類型、混雜文庫總量和雜交時間調整外顯子 panel 捕獲后的擴增循環數，避免過度擴增。以 Exome Plus Panel 為例，在快速雜交（4h）和過夜雜交（16h）的情況下，推薦常規 gDNA 樣本按表 3 選擇擴增循環數。
表3. NadPrep?建庫體系推薦的WES捕獲后擴增循環數
雜交時間
1-Plex
(500 ng)
4-Plex
(2 μg)
8-Plex
(4 μg)
12-Plex
(6 μg)
MGISEQ / DNBSEQ?
4 h
12
10
9
8
16 h
11
9
8
7-8
Illumina?
4 h
10
8
7
6
16 h
9
7
6
5-6
