低頻突變分析
應用背景
使用二代高通量測序平臺（Next generation sequencing, NGS）檢測樣本中的低頻變異，尤其是變異頻率低于 1% 時，真實變異容易淹沒在樣本保存、建庫擴增和測序過程中引入的背景噪音中。帶有分子標簽的接頭可對雙鏈分子進行標記并記錄其原始狀態。數據處理時通過分子標簽分析和同源家族（Consensus family）分析可有效排除核酸損傷、擴增錯誤以及測序錯誤等環節引入的假性突變。分子標簽靶向捕獲分析適用于多種應用場景，如：利用腫瘤病人血漿游離核酸進行腫瘤突變位點的檢測，利用懷孕母體血漿游離核酸進行胎兒單基因遺傳病的檢測，利用尿液游離核酸進行相關突變位點的檢測，利用石蠟樣本進行腫瘤突變位點的檢測，以及利用血液基因組 DNA 進行血液腫瘤微小殘余病灶的檢測等。
方案推薦
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文庫構建 |
封阻序列 |
靶向捕獲 |
測序平臺 |
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定制 panels |
MGISEQ / DNBSEQ? |
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定制 panels |
Illumina |
相關產品僅限研究使用，不用于臨床診斷。
模擬模型
來源于 2 個健康捐獻者的血漿游離 DNA 分別以 1% 和 0.3% 比例混合，用于模擬游離血漿 DNA 中低頻突變位點的檢測，文庫制備總投入量分別為 10 ng 和 25 ng；針對已知 SNP 位點設計捕獲 panel（圖1）。通過 MGISEQ-2000 測序平臺測序后，利用雙端分子標簽（Bi-molecular Identifer, BMI），在不同分析與過濾方法下進行低頻突變分析（表1）。
圖 1. 低頻突變模擬模型。
表 1. 分析與過濾方法
分析模式
詳情
No BMI
根據片段在基因組上比對的起始、終止位點去除重復。
SSCS
利用單鏈分子標簽進行一致性分析（Call Molecular Consensus Reads），形成單鏈一致性序列（Single Strand Consensus Sequences, SSCS）。
DCS211
利用雙鏈分子標簽，即互補鏈（Top / Bottom）分子標簽進行一致性分析，形成雙鏈一致性序列（Duplex Consensus Sequences, DCS），且Top與Bottom Reads均 ≥ 1。
DCS633
利用雙鏈分子標簽，即互補鏈（Top / Bottom）分子標簽進行一致性分析，形成 DCS，且 Top 與 Bottom Reads 均 ≥ 3。
DCS211 (≥ 2)
在 DCS211 的基礎上，支持該突變的 DCS 一致性序列 ≥ 2。
DCS633 (≥ 2)
在 DCS633 的基礎上，支持該突變的 DCS 一致性序列 ≥ 2。
靈敏度與陽性預測值
圖 2. 不同分析模式對于 1% 和 0.5% 模擬突變位點的 A. 靈敏度與 B. 陽性預測值；不同分析模式對于 0.3% 和 0.15% 模擬突變位點的 C. 靈敏度與 D. 陽性預測值。
更多詳情請參考 NadPrep?? 血漿游離 DNA 雙端分子標簽文庫構建試劑盒（for MGI）相關產品表現。
標準品分析示例
表 2. NanOnCT Panel v1.0 結合雙端分子標簽對 ctDNA 標準品的分析
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Variants |
MGISEQ-2000 |
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SSCS |
DCS211 |
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EGFR_L858R |
0.75% |
0.82% |
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EGFR_T790M |
1.29% |
1.38% |
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EGFR_delE746_A750 |
0.93% |
1.04% |
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PIK3CA_E545K |
0.92% |
0.8% |
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KRAS_G12D |
0.57% |
0.71% |
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KRAS_A146T |
1.01% |
0.67% |
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NRAS_Q61K |
1.31% |
0.89% |
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EGFR_insV769_D770 |
1.37% |
1.3% |
注：標準品為肺癌 ctDNA 標準品套裝，1% AF（菁良，GW-OCTM009），利用 NadPrep?? 系列雙端分子標簽文庫構建試劑盒建庫，NanOnCT Panel v1.0 對目標區域進行靶向富集，平均原始測序深度 ~ 30,000 x。
DCS211：Duplex consensus sequence，雙鏈一致性序列；
SSCS：Single strand consensus sequence，單鏈一致性序列。
模擬模型
來源于 2 個健康捐獻者的血漿游離 DNA 以 1% 比例混合，用于模擬游離血漿 DNA 中低頻突變位點的檢測，文庫制備總投入量為 10 ng；針對已知 SNP 位點設計捕獲 panel（圖3）。通過 Illumina HiSeq X,
PE150 平臺測序后，利用雙端分子標簽（UMI），在不同分析與過濾方法下進行低頻突變分析（表3）。
圖 3. 低頻突變模擬模型。來源于2個健康捐獻者的 cfDNA 以 1% 比例混合，文庫制備總投入量為 10 ng。1% 及 0.5% 模擬突變位點數量統計如右表所示。
表 3. 分析與過濾方法
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分析模式 |
詳情 |
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No UMI |
根據片段在基因組上比對的起始、終止位點去除重復。 |
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SSCS |
利用單鏈分子標簽進行一致性分析（Call Molecular Consensus Reads），形成單鏈一致性序列（Single Strand Consensus Sequences, SSCS）。 |
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DCS211 |
利用雙鏈分子標簽，即互補鏈（Top / Bottom）分子標簽進行一致性分析，形成雙鏈一致性序列（Duplex Consensus Sequences, DCS），且Top與Bottom Reads均 ≥ 1。 |
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DCS633 |
利用雙鏈分子標簽，即互補鏈（Top / Bottom）分子標簽進行一致性分析，形成 DCS，且 Top 與 Bottom Reads 均 ≥ 3。 |
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DCS211 (≥ 2) |
在 DCS211 的基礎上，支持該突變的 DCS 一致性序列 ≥ 2。 |
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DCS633 (≥ 2) |
在 DCS633 的基礎上，支持該突變的 DCS 一致性序列 ≥ 2。 |
突變頻率符合預期
圖 4. 1% 與 0.5% 模擬突變位點的頻率估算。
不同分析模式過濾背景“噪音”
圖 5. 不同分析模式對背景噪音的過濾。
靈敏度與陽性預測值
圖 6. 1% 和 0.5% 模擬突變位點在不同分析模式下的靈敏度（A）與陽性預測值（B）。
