HRD 分析的整體解決方案
應用背景
HRD 概述
同源重組修復（Homologous recombination repair，HRR）是正常細胞修復 DNA 的重要途徑。當 BRCA1/2 基因突變失去功能，會引起同源重組缺陷（Homologous Recombination Deficiency, HRD）。 HRR 通路其它基因，如 PALB2, CDK12，RAD51 等突變，及其他不明原因，都可能引起 HRD。 通常，HRD 導致的可檢測的基因現象：“基因組瘢痕”（genomic scars），包括：基因組雜合性缺失（Loss of Heterozygosity, LOH）、大片段遷移（Large-scale state Transition, LST）以及端粒等位基因不平衡（Telomeric Allelic Imbalance, TAI）[1-2]。
HRD 與 PARP 抑制劑
在正常細胞內，同源重組修復機制可讓細胞正常修復 DNA 復制錯誤并存活，而對于已發生 HRD 的腫瘤細胞，同時使用 PARP 抑制劑（PARPi）會導致 DNA 復制叉停滯和 DNA 復制無法順利進行進而誘導細胞凋亡，實現抗腫瘤的作用。
HRD 檢測的臨床意義
- 篩選鉑類及 PARPi 獲益人群，提供用藥指導
- 遺傳性疾病相關基因檢測（遺傳性乳腺癌-卵巢癌綜合征、林奇綜合征等）
方案推薦
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文庫構建 |
封阻序列 |
靶向捕獲 |
測序平臺 |
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&
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Illumina? Systems |
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MGISEQ / DNBSEQ? |
捕獲表現
圖 1. HRR Panel v1.0 的捕獲表現。 A. 比對率、中靶率及靶區域覆蓋度，B. 靶區域的覆蓋均一性和一致性。人類男性基因組 DNA (Promega, G1471) 利用 NadPrep? DNA 通用型文庫構建試劑盒 (for Illumina?) 建庫， 以 HRR Panel v1.0 進行捕獲，NovaSeq 6000，PE150 測序，按照 reads 數計算。
變異分析
圖 2. HRR Panel v1.0 應用于標準品的變異分析表現。泛腫瘤 800 gDNA 標準品 (菁良，GW-OGTM800) 利用 NadPrep? DNA 通用型文庫構建試劑盒 (for Illumina?) 建庫， 以 HRR Panel v1.0 進行雜交捕獲，NovaSeq 6000，PE150 測序， Vardict 進行變異分析。
與 HiSNP Ultra Panel 混合捕獲表現
圖 3. 混合捕獲表現。人類男性基因組 DNA (Promega, G1471, Normal)，泛腫瘤 800 gDNA 標準品 (菁良，GW-OGTM800) 和腫瘤 SNV 野生型 gDNA 標準品 (菁良，GW-OGTM005)，分別利用 NadPrep? DNA 通用型文庫構建試劑盒 (for Illumina?) 建庫， 以 HRR Panel v1.0 和 HiSNP Ultra Panel v1.0 等摩爾濃度混合后進行雜交捕獲，NovaSeq 6000，PE150 測序，按照 reads 數計算。A. 比對率和中靶率，B-C. 靶區域的覆蓋均一性和一致性表現。
健康 gDNA 標準品
圖 4. HiSNP 系列 Panel 分別在 MGI 和 Illumina 平臺的捕獲表現。 HiSNP (HiSNP Panel v1.0) 和 HiSNP Ultra (HiSNP Ultra Panel v1.0) 在兩個測序平臺的 A. 比對率和中靶率；B & C. 靶區域的覆蓋均一性和一致性表現。
注：樣本為人類男性基因組 DNA (Promega, G1471), 分別采用 NadPrep? DNA 通用型文庫構建試劑盒 (for MGI) 和 NadPrep? DNA 通用型文庫構建試劑盒 (for Illumina?) 建庫；MGI 平臺采用 MGISEQ-2000，PE 100 測序，Illumina 平臺采用 Novaseq 6000, PE 150 測序。
腫瘤 HRD 標準品
圖 5. HiSNP Ultra Panel v1.0 在雙測序平臺對 HRD 標準品的捕獲表現。 HiSNP Ultra Panel v1.0 對 HRD 標準品的捕獲數據比對率、中靶率、覆蓋度均一性和一致性表現。A & B. MGI 平臺；C & D. Illumina 平臺。
注：樣本為菁良腫瘤 HRD 標準品 GW-HRD-3 (GW3)，GW-HRD-9 (GW9) 和 GW-HRD-12 (GW12)，包含 Normal (N) 和 Tumor (T) 細胞系配對樣本，分別采用 NadPrep? DNA 通用型文庫構建試劑盒 (for MGI) 和 NadPrep? DNA 通用型文庫構建試劑盒 (for Illumina?) 建庫；MGI 平臺采用 MGISEQ-2000，PE 100 測序，Illumina 平臺采用 Novaseq 6000, PE 150 測序。
圖 6. HiSNP Ultra Panel v1.0 對 HRD 標準品的檢測結果。WGS、WES (Exome Plus Panel v2.0) 和 HiSNP Ultra 均可用于 HRD Score 分析， HiSNP Ultra 相較于 WES 更接近于 WGS 和標準品參考值。
注：樣本為菁良腫瘤 HRD 標準品，采用 NadPrep? DNA 通用型文庫構建試劑盒 (for Illumina?) 建庫；采用 Novaseq 6000, PE 150 測序。WGS 測序數據的分析軟件為 TITAN v1.17.1，WES 和 HiSNP Ultra 捕獲數據的分析軟件為 scarHRD v1.0。 WGS、WES 和 HiSNP Ultra 的測序深度分別 ＞ 30x、300x、450x。
腫瘤純度與 HRD Score
圖 7. 腫瘤純度對 HRD Score 分析的影響。 In silicon 模擬不同純度的腫瘤樣本，使用 scarHRD v1.0 軟件分別對腫瘤 HRD 標準品分析 Ploidy、Purity 和 HRD Score。當腫瘤樣本純度＞30-40% 時，HRD Score 值比較穩定且接近于參考值。
注：樣本為菁良腫瘤 HRD 標準品 GW3、GW9 和 GW12；采用 NadPrep? DNA 通用型文庫構建試劑盒 ( for Illumina?) 建庫；測序平臺：Novaseq 6000, PE 150。
測序深度與 HRD Score
圖 8. 測序深度對 HRD Score 分析的影響。 對測序數據進一步 downsampling 至 250x、200x、150x、100x、50x，使用 scarHRD v1.0 軟件分別對腫瘤 HRD 標準品分析 HRD Score、Purity 和 Ploidy。當樣本腫瘤含量為 100% 時，測序深度低至 50x 依然可準確分析 HRD Score 值。
注：樣本為菁良腫瘤 HRD 標準品 GW3、GW9 和 GW12；采用 NadPrep? DNA 通用型文庫構建試劑盒 (for Illumina?) 建庫；測序平臺：Novaseq 6000, PE 150。
考慮到實際檢測樣本的腫瘤純度不可能達到 100%，因此 In silicon 模擬了腫瘤純度在 30%-40% 之間的樣本，以評估測序深度對 HRD Score 分析的影響。
腫瘤純度、測序深度與 HRD Score
圖 9. 腫瘤純度與測序深度對 HRD Score 分析的影響。In silicon 模擬不同純度（30%-40%）的腫瘤樣本，同時對測序數據 (450x) 進行 downsampling 至 250x、200x、150x、100x、50x，使用 scarHRD v1.0 軟件分別對腫瘤 HRD 標準品分析 Ploidy、Purity 和 HRD Score。由于真實樣本的腫瘤純度和倍性不同，故推薦測序深度＞300x，500x 為佳。
注：樣本為菁良腫瘤 HRD 標準 品 GW3、GW9 和 GW12；采用 NadPrep? DNA 通用型文庫構建試劑盒 (for Illumina?) 建庫；測序平臺：Novaseq 6000, PE 150。
方案總結
HRD 檢測的使用推薦- HiSNP Ultra Panel v1.0 適用于 HRD Score 分析，其表現優于 WES，更接近于 WGS 和標準品參考值
- HRD Score 分析要求樣本腫瘤純度 ＞30%，測序深度 ＞300x
- HRD 臨床檢測的可行性依賴于多種 Panel 同時使用，具體推薦如下：
圖 7. HiSNP Ultra Panel 助力 HRD 檢測落地的設計方案。
參考文獻
[1] Stewart R A, Pilié P G, Yap T A. Development of PARP and immune-checkpoint inhibitor combinations[J]. Cancer research, 2018, 78(24): 6717-6725.
[2] Watkins J A, Irshad S, Grigoriadis A, et al. Genomic scars as biomarkers of homologous recombination deficiency and drug response in breast and ovarian cancers[J]. Breast Cancer Research, 2014, 16(3): 1-11.
