Ext-RNA Control Panel
#1001651 (96 rxn)
ERCC（External RNA Controls Consortium）是由美國國家標準與技術研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）發起開發的序列和濃度己知的外源標準 RNA 轉錄本。這些轉錄本序列主要從隨機特異序列中生成，在包括人類在內的多個模式生物數據庫中未找到同源序列。
Ext-RNA Control Panel v1.0 靶向 92 條ERCC轉錄本中的 24 條，長度范圍為：273-2,022 bp；其在 ERCC RNA Spike-In Mix 1（Life Technologies，Part no. 4456740）中的濃度范圍為：0.014305-937.5 attomol/μl。此 24 條 ERCC 可為 RNA 表達定量提供參考。
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產品列表
表1. ERCC ID 號及其對應濃度和轉錄本長度
|
ERCC ID |
濃度
(attomol/μL） |
長度
(bp) |
ERCC ID |
濃度
(attomol/μL) |
長度
(bp) |
ERCC ID |
濃度
(attomol/μL) |
長度
(bp) |
|
ERCC-00057 |
0.014305 |
1,021 |
ERCC-00058 |
1.831055 |
1,136 |
ERCC-00170 |
14.64844 |
525 |
|
ERCC-00017 |
0.114441 |
1,136 |
ERCC-00077 |
3.662109 |
743 |
ERCC-00084 |
29.29688 |
994 |
|
ERCC-00016 |
0.228882 |
844 |
ERCC-00150 |
3.662109 |
273 |
ERCC-00025 |
58.59375 |
1,994 |
|
ERCC-00156 |
0.457764 |
494 |
ERCC-00034 |
7.324219 |
844 |
ERCC-00071 |
58.59375 |
642 |
|
ERCC-00158 |
0.457764 |
1,027 |
ERCC-00085 |
7.324219 |
1,019 |
ERCC-00112 |
117.1875 |
1,136 |
|
ERCC-00109 |
0.915527 |
536 |
ERCC-00157 |
7.324219 |
1,019 |
ERCC-00092 |
234.375 |
1,124 |
|
ERCC-00137 |
0.915527 |
537 |
ERCC-00059 |
14.64844 |
1,023 |
ERCC-00042 |
468.75 |
1,023 |
|
ERCC-00033 |
1.831055 |
2,022 |
ERCC-00126 |
14.64844 |
1,118 |
ERCC-00108 |
937.5 |
1,022 |
實驗流程
圖1. RNA 靶向捕獲流程。
產品表現
ERCC 標準曲線
圖2. ERCC 標準曲線。建庫時添加 ERCC 標準品，在 RNA-Seq 或 RNACap 中，ERCC RPKM（Reads Per Kilobase per Million mapped reads）與樣本濃度間呈現良好的線性關系；RNACap 與 RNA-seq 相比表現出明顯的靶基因富集。
對 ERCC 基因的覆蓋分析
圖3. ERCC 基因覆蓋分析，不同建庫方式對 ERCC 基因的覆蓋無顯著差異，RNACap 未表現出明顯偏好性。 RNACap（藍色）：將總 RNA 反轉成雙鏈 DNA 后進行靶向建庫測序；rRNA-depleted（橙色）：對總 RNA 進行去除 rRNA 處理，反轉成雙鏈 DNA 后進行建庫測序；Total RNA（深藍）：直接將總 RNA 反轉成雙鏈 DNA 并進行建庫測序。
Spike-in 至不同 panel 中的重復性表現
圖4. Ext-RNA Control Panel v1.0 Spike-in 至不同 panel 后的重復性表現。將 Ext-RNA Control Panel v1.0 Spike-in 至 NanOnco Plus Panel v2.0（大 panel）或 NanOnCT Panel v1.0（小 panel），捕獲測序后對二者的 ERCC RPKM 的 log 值進行相關性分析。
本產品僅限研究使用，不用于臨床診斷。
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貨號 |
管蓋
顏色 |
產品名稱 |
包裝 體積 |
包裝/儲存溫度 |
|
1001652 |
|
Ext-RNA Control Panel v1.0, 16 rxn |
70 μL |
–20℃ |
|
1001651 |
|
Ext-RNA Control Panel v1.0, 96 rxn |
415 μL |
–20℃ |
推薦如下：
? 對于 Size 分布均一、所需測序數據量相同的文庫，一般在文庫混雜投入比＞50 % 的前提下，推薦 500 ng/文庫的投入量，以期提高文庫豐富度，降低測序數據的重復率；
? 對于 Size 分布不均一、樣本質量差異較大、所需測序數據量不同的文庫，一般在文庫混雜比＞50 % 的前提下，推薦按照摩爾量進行相應比例的混合。
注：1. 混雜投入比=樣本進入雜交反應的文庫量/樣本實際文庫構建產出總量*100 %；
2. moles of dsDNA (mol) = mass of dsDNA (g) / ((length of dsDNA (bp) x 617.96 g/mol) + 36.04 g/mol)
目前混合文庫的濃縮推薦采用真空濃縮法或磁珠濃縮法，具體操作可參考DNA文庫雜交捕獲操作指南。相關測試結果表明不同濃縮法的結果基本一致，僅存在輕微GC差異偏好。但真空法更經濟、操作簡單，而磁珠法則可適配自動化工作站，可根據具體情況進行選擇：
|
濃縮方式 |
優點 |
缺點 |
|
真空濃縮 |
操作簡便、時間可控、損失低 |
需要真空濃縮儀 |
|
磁珠濃縮 |
無需另購儀器、可適配自動化工作站 |
存在DNA損失且需求試劑量增加、存在GC偏好性 |
捕獲終文庫得量與許多因素存在相關性，除去實驗操作影響外，一般會有以下理論影響因素：樣本類型、起始混雜文庫總量、Panel 大小、雜交時長、擴增循環數等。為獲得良好的實驗數據，在滿足上機測序所需用量的前提下，應盡量控制捕獲后擴增循環數。Illumina?平臺在上機測序前會對文庫進行指數式擴增的成簇反應，故所需的上機文庫總量較低（具體需要根據各測序儀型號以及測序公司要求決定）。對于不同 Panel，可在實驗初期參考以下推薦列表，后期再根據具體結果進行調整：
|
Panel大小 |
1-plex （500 ng） |
4-plex （2,000 ng） |
8-plex （4,000 ng） |
12-plex （6,000 ng） |
|---|---|---|---|---|
|
＞10 Mb |
10 cycles |
8 cycles |
7 cycles |
6 cycles |
|
1 Mb-10 Mb |
12 cycles |
10 cycles |
9 cycles |
8 cycles |
|
50 Kb- 1Mb |
13 cycles |
11 cycles |
10 cycles |
10 cycles |
|
1 Kb-50 Kb |
14 cycles |
12 cycles |
11 cycles |
11 cycles |
針對納昂達商品化 Panel，可參考下表進行選擇：
|
Panel名稱 |
大小 |
混雜 |
Post-Capture 擴增循環數 |
捕獲文庫產出（ng） |
|---|---|---|---|---|
|
Exome Plus Panel 2.0 |
~46 Mb |
1-plex（500 ng） |
8 |
~70 |
|
12-plex（6,000 ng） |
6 |
~200 |
||
|
NanOnco Plus Panel v2.0 |
~2.6 Mb |
1-plex（500 ng） |
10 |
~120 |
|
12-plex（6,000 ng） |
7 |
~80 |
||
|
NanoHema Research Panel v1.0 |
~1 Mb |
1-plex（500 ng） |
11 |
~70 |
|
12-plex（6,000 ng） |
7 |
~80 |
||
|
NanOnCT Panel v1.0 |
~0.4 Mb |
1-plex（500 ng） |
12 |
~80 |
|
12-plex（6,000 ng） |
8 |
~80 |
||
|
LungCancer Panel v1.0 |
~0.23 Mb |
1-plex（500 ng） |
14 |
~100 |
|
12-plex（6,000 ng） |
11 |
~70 |
捕獲終文庫得量與許多因素存在相關性，除去實驗操作影響外，一般會有以下理論影響因素：樣本類型、起始混雜文庫總量、Panel大小、雜交時長、擴增循環數等。為獲得良好的實驗數據，在滿足上機測序所需用量的前提下，應盡量控制捕獲后擴增循環數。MGI測序平臺需要在上機前對文庫進行環化，接著再進行滾環式擴增成DNA納米球（DNA Nanoball）的過程。故所需的上機文庫總量高于Illumina? 平臺（具體需要根據各測序儀型號以及測序公司要求決定）。根據NadPrep?通用環化試劑盒（for MGI）(貨號：1002231）使用說明書V1.0版本描述，環化所需文庫推薦投入量至少＞1 pmol，因此我們推薦：
? 對于大型Panel的多樣本混雜文庫，由于可能所測數據量較多，建議至少需要滿足＞1 pmol的總量（＞300 ng）；
? 對于大型Panel的少量樣本混雜文庫，由于后續會與其他文庫混合上機測序，所需文庫總量可適當降低。但建議混合送測文庫總量＞1 pmol（＞300 ng）；
對于小型Panel的混雜文庫，由于后續會與其他文庫混合上機測序，所需文庫總量可適當降低。但建議混合送測文庫總量＞1 pmol（＞300 ng）。
基于上述總量，針對特定類型的Panel，可根據測試結果調整捕獲后擴增循環數。針對納昂達商品化Panel，可參考下表：
|
Panel名稱 |
大小 |
混雜 |
Post-Capture擴增循環數 |
捕獲文庫產出（ng） |
|
Exome Plus Panel 2.0 |
~46 Mb |
1-plex（500 ng） |
8 |
~70 |
|
|
|
12-plex（6,000 ng） |
6 |
~200 |
|
NanOnco Plus Panel v2.0 |
~2.6 Mb |
1-plex（500 ng） |
10 |
~120 |
|
|
|
12-plex（6,000 ng） |
7 |
~80 |
|
NanoHema Research Panel v1.0 |
~1 Mb |
1-plex（500 ng） |
11 |
~70 |
|
|
|
12-plex（6,000 ng） |
7 |
~80 |
|
NanOnCT Panel v1.0 |
~0.4 Mb |
1-plex（500 ng） |
12 |
~80 |
|
|
|
12-plex（6,000 ng） |
8 |
~80 |
|
LungCancer Panel v1.0 |
~0.23 Mb |
1-plex（500 ng） |
14 |
~100 |
|
|
|
12-plex（6,000 ng） |
11 |
~70 |
說明：以上為納昂達針對gDNA或標準品在16 h雜交時長下的經驗循環數及產出。不同實驗室因樣本類型、實驗條件、實驗環境不同可能有所差異。
針對NadPrep?系列產品，在文庫構建及靶向捕獲時的擴增引物如下：
|
接頭類型 |
Pre-Capture 擴增引物 |
Post-Capture 擴增引物 |
說明 |
|---|---|---|---|
|
NadPrep?UDI Adapter |
NadPrep?Amplification Primer Mix |
NadPrep?Amplification Primer Mix |
Illumina?平臺 |
|
NadPrep?M-Adapter / BMI Adapter (SI) |
NadPrep?M-Index Primer Mix (SI) |
M-Amplification Primer Mix (SI) |
MGI平臺 |
|
NadPrep?M-Adapter / BMI Adapter (DI) |
NadPrep?M-Index Primer Mix (MDI) |
M-Amplification Primer Mix (DI) |
MGI平臺 |
NadPrep?系列建庫試劑盒（96 rxn）已包含 Pre/Post-Capture 的相關引物。其中 Post-PCR 引物均為 Illumina 或 MGI 平臺通用引物，也可使用其它同類型產品替代。
為了解除帶有生物素標記的文庫與鏈霉親和素磁珠的結合，可嘗試使用以下二者操作之一（或參考 M270 磁珠官方建議）：
? 溶于 10 mM EDTA、95% 甲酰胺、pH 8.2 的溶液中，混勻并于 65℃下加熱 5 min或 90℃下加熱 2 min；
? 溶于 0.1 % SDS，混勻并加熱煮沸 5 min。
盡管雜交捕獲體系已經過優化，適用于更短時間的雜交。但與 16 h 雜交相比，不同類型的 Panel 隨著雜交時長的縮短，在捕獲文庫總量、捕獲效率、覆蓋均一性等方面皆存在不同程度的降低，詳見下圖。相比中大型 Panel（＞0.4 Mb），小型 Panel（＜0.4 Mb）受到的影響更大。對于有時效性要求的，可對大型 Panel 嘗試縮短雜交時間，但不建議將此種情況用于小型 Panel。
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產品 |
貨號 |
|
Ext-RNA Control Panel v1.0, 16 rxn |
1001652 |
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Ext-RNA Control Panel v1.0, 96 rxn |
1001651 |
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