NanOnCT Panel
#1001901 (96 rxn)
NanOnCT Panel v1.0 靶向實體瘤研究中被著重關注的 69 個基因，覆蓋基因組約 375 kb 區域。支持包括堿基替換，插入 / 缺失，基因重排，基因擴增，微衛星穩定性在內的多種變異信 息的富集。其探針設計經過優化，提升了對細胞外游離 DNA（Cell-free DNA, cfDNA）文庫的捕獲效果。
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基因列表
編碼區覆蓋
|
AKT1 |
ALK |
APC |
AR |
ARAF |
ATM |
BRAF |
BRCA1 |
BRCA2 |
CCND1 |
|
CDH1 |
CDK12 |
CDK4 |
CDK6 |
CDKN2A |
CTNNB1 |
DDR2 |
EGFR |
ERBB2 |
ERCC2 |
|
ESR1 |
EZH2 |
FGFR1 |
FGFR2 |
FGFR3 |
GNA11 |
GNAQ |
GNAS |
HRAS |
IDH1 |
|
IDH2 |
JAK2 |
JAK3 |
KDM6A |
KIT |
KRAS |
MAP2K1 |
MAP2K2 |
MDM2 |
MET |
|
MLH1 |
MPL |
MSH2 |
MSH6 |
MTOR |
MYC |
NF1 |
NPM1 |
NRAS |
NTRK1 |
|
NTRK2 |
NTRK3 |
PDGFRA |
PIK3CA |
PMS2 |
PTCH1 |
PTEN |
PTPN11 |
RAF1 |
RB1 |
|
RET |
ROS1 |
SMARCB1 |
SMO |
STK11 |
TERT |
TP53 |
TSC1 |
TSC2 |
|
非編碼區覆蓋
|
ALK |
BRAF |
EGFR |
FGFR2 |
FGFR3 |
MET |
NTRK1 |
NTRK2 |
PDGFRA |
RET |
ROS1 |
微衛星位點
|
BAT-25 |
BAT-26 |
BAT-40 |
BAT-RII |
NR-21 |
NR-22 |
NR-24 |
NR-27 |
MONO-27 |
|
D2S123 |
D5S346 |
D17S261 |
D17S520 |
D18S34 |
產品表現
表1. NanOnCT Panel v1.0 對 gDNA 和 cfDNA 文庫的捕獲表現
|
gDNA 捕獲效率（%） |
cfDNA 捕獲效率（%） |
|
|
HiSeq X Ten, PE150 |
87.02 |
87.35 |
|
MGISEQ-2000, PE100 |
85.47 |
87.00 |
優化的探針設計
圖1. 優化探針設計的 NanOnCT Panel v1.0 對 cfDNA 文庫的目標區域捕獲覆蓋更加均一。
多種變異分析
圖2. NanOnCT Panel v1.0 捕獲數據中變異頻率與標準品標稱頻率的一致性。注：標準品為腫瘤 SNV1-25% gDNA 標準品（菁良，GW-OGTM004）。
特定微衛星覆蓋
圖4. NanOnCT Panel v1.0 在 HiSeq X Ten 平臺對 14 個微衛星有效覆蓋。可跨過微衛星序列全長的讀長被計為有效讀長（Effective reads）。
表2. NanOnCT Panel v1.0 對血液 gDNA / FFPE / 血漿cfDNA / 尿液 cfDNA 等樣本類型文庫的捕獲表現
|
血液 gDNA |
血漿 cfDNA |
嚴重降解 FFPE |
尿液 cfDNA |
|
|
以 reads 計算的中靶率（%） |
87.0 |
83.7 |
85.2 |
82.6 |
|
覆蓋深度 ≥ 0.2 x 平均值的靶區比例（%） |
100.0 |
100.0 |
100.0 |
99.9 |
|
覆蓋深度 ≥ 0.5 x 平均值的靶區比例（%） |
99.9 |
98.6 |
84.9 |
93.2 |
本產品僅限研究使用，不用于臨床診斷。
|
貨號 |
管蓋
顏色 |
產品名稱 |
包裝
體積 |
包裝/儲存溫度 |
|
1001902 |
|
NanOnCT Panel v1.0, 16 rxn |
70 μL |
–20℃ |
|
1001901 |
|
NanOnCT Panel v1.0, 96 rxn |
415 μL |
–20℃ |
推薦如下：
? 對于 Size 分布均一、所需測序數據量相同的文庫，一般在文庫混雜投入比＞50 % 的前提下，推薦 500 ng/文庫的投入量，以期提高文庫豐富度，降低測序數據的重復率；
? 對于 Size 分布不均一、樣本質量差異較大、所需測序數據量不同的文庫，一般在文庫混雜比＞50 % 的前提下，推薦按照摩爾量進行相應比例的混合。
注：1. 混雜投入比=樣本進入雜交反應的文庫量/樣本實際文庫構建產出總量*100 %；
2. moles of dsDNA (mol) = mass of dsDNA (g) / ((length of dsDNA (bp) x 617.96 g/mol) + 36.04 g/mol)
目前混合文庫的濃縮推薦采用真空濃縮法或磁珠濃縮法，具體操作可參考DNA文庫雜交捕獲操作指南。相關測試結果表明不同濃縮法的結果基本一致，僅存在輕微GC差異偏好。但真空法更經濟、操作簡單，而磁珠法則可適配自動化工作站，可根據具體情況進行選擇：
|
濃縮方式 |
優點 |
缺點 |
|
真空濃縮 |
操作簡便、時間可控、損失低 |
需要真空濃縮儀 |
|
磁珠濃縮 |
無需另購儀器、可適配自動化工作站 |
存在DNA損失且需求試劑量增加、存在GC偏好性 |
捕獲終文庫得量與許多因素存在相關性，除去實驗操作影響外，一般會有以下理論影響因素：樣本類型、起始混雜文庫總量、Panel 大小、雜交時長、擴增循環數等。為獲得良好的實驗數據，在滿足上機測序所需用量的前提下，應盡量控制捕獲后擴增循環數。Illumina?平臺在上機測序前會對文庫進行指數式擴增的成簇反應，故所需的上機文庫總量較低（具體需要根據各測序儀型號以及測序公司要求決定）。對于不同 Panel，可在實驗初期參考以下推薦列表，后期再根據具體結果進行調整：
|
Panel大小 |
1-plex （500 ng） |
4-plex （2,000 ng） |
8-plex （4,000 ng） |
12-plex （6,000 ng） |
|---|---|---|---|---|
|
＞10 Mb |
10 cycles |
8 cycles |
7 cycles |
6 cycles |
|
1 Mb-10 Mb |
12 cycles |
10 cycles |
9 cycles |
8 cycles |
|
50 Kb- 1Mb |
13 cycles |
11 cycles |
10 cycles |
10 cycles |
|
1 Kb-50 Kb |
14 cycles |
12 cycles |
11 cycles |
11 cycles |
針對納昂達商品化 Panel，可參考下表進行選擇：
|
Panel名稱 |
大小 |
混雜 |
Post-Capture 擴增循環數 |
捕獲文庫產出（ng） |
|---|---|---|---|---|
|
Exome Plus Panel 2.0 |
~46 Mb |
1-plex（500 ng） |
8 |
~70 |
|
12-plex（6,000 ng） |
6 |
~200 |
||
|
NanOnco Plus Panel v2.0 |
~2.6 Mb |
1-plex（500 ng） |
10 |
~120 |
|
12-plex（6,000 ng） |
7 |
~80 |
||
|
NanoHema Research Panel v1.0 |
~1 Mb |
1-plex（500 ng） |
11 |
~70 |
|
12-plex（6,000 ng） |
7 |
~80 |
||
|
NanOnCT Panel v1.0 |
~0.4 Mb |
1-plex（500 ng） |
12 |
~80 |
|
12-plex（6,000 ng） |
8 |
~80 |
||
|
LungCancer Panel v1.0 |
~0.23 Mb |
1-plex（500 ng） |
14 |
~100 |
|
12-plex（6,000 ng） |
11 |
~70 |
捕獲終文庫得量與許多因素存在相關性，除去實驗操作影響外，一般會有以下理論影響因素：樣本類型、起始混雜文庫總量、Panel大小、雜交時長、擴增循環數等。為獲得良好的實驗數據，在滿足上機測序所需用量的前提下，應盡量控制捕獲后擴增循環數。MGI測序平臺需要在上機前對文庫進行環化，接著再進行滾環式擴增成DNA納米球（DNA Nanoball）的過程。故所需的上機文庫總量高于Illumina? 平臺（具體需要根據各測序儀型號以及測序公司要求決定）。根據NadPrep?通用環化試劑盒（for MGI）(貨號：1002231）使用說明書V1.0版本描述，環化所需文庫推薦投入量至少＞1 pmol，因此我們推薦：
? 對于大型Panel的多樣本混雜文庫，由于可能所測數據量較多，建議至少需要滿足＞1 pmol的總量（＞300 ng）；
? 對于大型Panel的少量樣本混雜文庫，由于后續會與其他文庫混合上機測序，所需文庫總量可適當降低。但建議混合送測文庫總量＞1 pmol（＞300 ng）；
對于小型Panel的混雜文庫，由于后續會與其他文庫混合上機測序，所需文庫總量可適當降低。但建議混合送測文庫總量＞1 pmol（＞300 ng）。
基于上述總量，針對特定類型的Panel，可根據測試結果調整捕獲后擴增循環數。針對納昂達商品化Panel，可參考下表：
|
Panel名稱 |
大小 |
混雜 |
Post-Capture擴增循環數 |
捕獲文庫產出（ng） |
|
Exome Plus Panel 2.0 |
~46 Mb |
1-plex（500 ng） |
8 |
~70 |
|
|
|
12-plex（6,000 ng） |
6 |
~200 |
|
NanOnco Plus Panel v2.0 |
~2.6 Mb |
1-plex（500 ng） |
10 |
~120 |
|
|
|
12-plex（6,000 ng） |
7 |
~80 |
|
NanoHema Research Panel v1.0 |
~1 Mb |
1-plex（500 ng） |
11 |
~70 |
|
|
|
12-plex（6,000 ng） |
7 |
~80 |
|
NanOnCT Panel v1.0 |
~0.4 Mb |
1-plex（500 ng） |
12 |
~80 |
|
|
|
12-plex（6,000 ng） |
8 |
~80 |
|
LungCancer Panel v1.0 |
~0.23 Mb |
1-plex（500 ng） |
14 |
~100 |
|
|
|
12-plex（6,000 ng） |
11 |
~70 |
說明：以上為納昂達針對gDNA或標準品在16 h雜交時長下的經驗循環數及產出。不同實驗室因樣本類型、實驗條件、實驗環境不同可能有所差異。
針對NadPrep?系列產品，在文庫構建及靶向捕獲時的擴增引物如下：
|
接頭類型 |
Pre-Capture 擴增引物 |
Post-Capture 擴增引物 |
說明 |
|---|---|---|---|
|
NadPrep?UDI Adapter |
NadPrep?Amplification Primer Mix |
NadPrep?Amplification Primer Mix |
Illumina?平臺 |
|
NadPrep?M-Adapter / BMI Adapter (SI) |
NadPrep?M-Index Primer Mix (SI) |
M-Amplification Primer Mix (SI) |
MGI平臺 |
|
NadPrep?M-Adapter / BMI Adapter (DI) |
NadPrep?M-Index Primer Mix (MDI) |
M-Amplification Primer Mix (DI) |
MGI平臺 |
NadPrep?系列建庫試劑盒（96 rxn）已包含 Pre/Post-Capture 的相關引物。其中 Post-PCR 引物均為 Illumina 或 MGI 平臺通用引物，也可使用其它同類型產品替代。
為了解除帶有生物素標記的文庫與鏈霉親和素磁珠的結合，可嘗試使用以下二者操作之一（或參考 M270 磁珠官方建議）：
? 溶于 10 mM EDTA、95% 甲酰胺、pH 8.2 的溶液中，混勻并于 65℃下加熱 5 min或 90℃下加熱 2 min；
? 溶于 0.1 % SDS，混勻并加熱煮沸 5 min。
盡管雜交捕獲體系已經過優化，適用于更短時間的雜交。但與 16 h 雜交相比，不同類型的 Panel 隨著雜交時長的縮短，在捕獲文庫總量、捕獲效率、覆蓋均一性等方面皆存在不同程度的降低，詳見下圖。相比中大型 Panel（＞0.4 Mb），小型 Panel（＜0.4 Mb）受到的影響更大。對于有時效性要求的，可對大型 Panel 嘗試縮短雜交時間，但不建議將此種情況用于小型 Panel。
|
產品 |
貨號 |
|
NanOnCT Panel v1.0, 16 rxn |
1001902 |
|
NanOnCT Panel v1.0, 96 rxn |
1001901 |
產品資料
應用指南
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