μCaler? MRD Solution (for Illumina?)
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μCaler? Panel 是基于納昂達自主知識產權采取創新型方案設計推出的商品化或定制化 Panel (μCaler? Custom Panel)，必須與 μCaler? MRD Solution (for Illumina?) 搭配使用，其能夠在反應體系中快速尋找結合位置，多條探針結合目標區域后進一步穩固。
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μCaler? Hybrid System 工作原理示意圖
- 探針尋找靶標形成穩定結合
- 多條探針共軛效應快速結合進一步穩固
產品特色
- 搭載分子標簽接頭，滿足 MRD 對于低頻突變分析的要求
- 快速雜交，單日內完成捕獲文庫構建的全流程
- 專門針對小 Panel 設計優化，具有出色穩定的捕獲表現
- 實驗流程簡化升級，操作更便捷
產品表現
更快速
更穩定
不同樣本類型及投入量
圖 1. μCaler? MRD Solution 對不同起始投入量的 cfDNA 和 gDNA 文庫的捕獲表現。A. 捕獲數據比對率和捕獲效率；B. 靶區域覆蓋度；C. Fold 80 base penalty。健康人源混合 cfDNA 標準品和健康人類基因組 DNA (Promega，G1471) 利用 μCaler? MRD Solution (for Illumina?) 和 M71 (8.5 Kb, GC range 25-70%) 完成雜交捕獲。利用 BWA 比對到參考基因組 hg38，On-target 按照 reads 數計算。測序模式為 Illumina Novaseq 6000，PE150。
不同類型 Panel
圖 2. μCaler? MRD Solution 對不同類型 Panel 的捕獲表現。A. 捕獲數據比對率和捕獲效率；B. 靶區域覆蓋度；C. Fold 80 base penalty。健康人類基因組 DNA (Promega，G1471) 利用 μCaler? MRD Solution (for Illumina?)，分別以 M27 (3.2 Kb, GC range 25-55%)、M44 (5.28 Kb, GC range 25-70%)、M50 (5 Kb, GC range 37-90%) 和 M580 (58 Kb, GC range 19-99%) 完成雜交捕獲。利用 BWA 比對到參考基因組 hg38，On-target 按照 reads 數計算。測序模式為 Illumina Novaseq 6000，PE150。
標準品變異一致性分析
樣本來源于泛腫瘤 800 gDNA 標準品 (Genewell, GW-OGTM800) 健康人類基因組 DNA (Promega, G1471) 分別按 10：0 和 1：9 混合，人工模擬不同突變頻率。泛腫瘤 800 gDNA 標準品不同突變位點的理論突變頻率如下：
圖 3. μCaler? Panel 和 Traditional Panel 捕獲數據中變異頻率與標準品頻率的一致性。30 ng 模擬樣本利用 μCaler? Hybrid System 和傳統雜交捕獲體系， 分別以 μCaler? Panel 和 Traditional Panel 完成雜交捕獲，DownSampling 每樣本數據至去重前 80,000x 測序深度分析突變的檢出一致性 (預文庫含 UMI 分子標簽)，分析過濾標準為單鏈一致性序列 (family size ≥ 3) (SSCS ≥ 3)。測序模式為 Illumina Novaseq 6000，PE150。
定制 SNP 組合模擬低頻突變的極限檢出
樣本來源于 2 名健康捐獻者的 gDNA 分別以 99：1、999：1 以及 9999：1 的比例混合，人工模擬不同突變頻率。
圖 4. μCaler? Panel 和 Traditional Panel 對低頻突變的檢出表現。50 ng 模擬樣本利用 μCaler? Hybrid System 和傳統雜交捕獲體系， 分別以 μCaler? Panel (~ 3 Kb target region，覆蓋 30 個等位基因位點) 和 Traditional Panel (~ 42 Kb target region，覆蓋 160 個等位基因位點，包含上述 30 個位點) 完成雜交捕獲，3 次 Downsampling 每一對樣本至同一深度 (預文庫含 UMI 分子標簽)，以雙鏈一致性序列 (DCS211) 以及 SSCS ≥ 3 分析突變位點的檢出情況。支持突變的平均有效 reads ≥1 判為陽性。測序模式為 Illumina Novaseq 6000，PE150。
圖 5. μCaler? Panel 和 Traditional Panel 對低頻突變的檢出及理論檢出的比較分析。
注：Theoretical number of mutation 為 DCS211 深度 2,750x，不同突變頻率做 10,000 次隨機取樣，突變檢出的分布規律。
| 包裝編號 | 子包裝名稱 | 管/瓶蓋顏色 | 組分 | 包裝體積 |
| Box 1 | 文庫構建 & 雜交 |
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EndRepair & A-Tailing Buffer | 100 μL |
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EndRepair & A-Tailing Enzyme | 65 μL | ||
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Ligation Buffer | 380 μL | ||
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DNA ligase | 65 μL | ||
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2X HiFi PCR Master Mix | 1450 μL | ||
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/ |
Nuclease Free Water | 4 mL | ||
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TE Sloution | 1000 μL | ||
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|
μCaler NanoBlockers (for Illumina) | 60 μL | ||
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Human Cot DNA | 60 μL | ||
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μHyb #1 | 1100 μL | ||
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μHyb #2 | 180 μL | ||
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NadPrep Amplification Primer Mix II | 75 μL | ||
| UMI 接頭 |
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NadPrep UMI Adapter | 60 μL | |
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NadPrep Universal UDI-Index Primer Mix | 12×15 μL | ||
| 定制探針 |
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μCaler Custom Panel | 60 μL | |
| Box 2 | 洗脫 |
/ |
NadPrep SP beads | 4 mL |
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Streptavidin Beads | 750 μL | ||
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/ |
Wash Buffer A | 2×8 mL | ||
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/ |
Wash Buffer B | 4.7 mL |
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可能原因 |
解決方案 |
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起始投入量過量 |
建議使用 Qubit? 3.0 進行定量 |
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擴增循環數偏高 |
根據操作指南推薦摸索最佳擴增循環數 |
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洗脫過程未按照操作指南進行，導致脫靶嚴重 |
洗脫過程嚴格按照操作指南要求進行操作 |
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可能原因 |
解決方案 |
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起始投入量不準確 |
實際起始投入量偏低，建議使用 qPCR 進行精確定量 |
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轉管時未將反應液全部轉出 |
轉管時務必將每一步的溶液全部轉移至新的反應管 |
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雜交以及磁珠純化過程丟棄部分磁珠 |
洗脫過程操作避免過于劇烈，棄上清過程切勿丟失磁珠 |
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可能原因 |
解決方案 |
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洗脫過程產生大量氣泡 |
移液器使用時需輕柔吹吸混勻，避免進入空氣；若產生氣泡，可先用移液器將液面上方氣泡吸干凈后再棄上清 |
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未更換 PCR 管蓋 |
嚴格按照說明書要求更換 PCR 管以及管蓋 |
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試劑未完全混勻 |
試劑使用前嚴格按照操作指南要求進行混勻，并置于相應的溫度預熱 |
如何提高 NGS 方案對于低頻突變信號的檢出率？
① 增加樣本投入量：樣本起始量越多，支持低頻突變檢出的模板拷貝數越多；
② 增加跟蹤突變數量：突變位點數量越高，檢出概率越高。
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Van Der Pol Y, Mouliere F. Toward the early detection of cancer by decoding the epigenetic and environmental fingerprints of cell-free DNA[J]. Cancer cell, 2019, 36(4): 350-368.
不同實驗條件下對應的突變檢測下限
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文庫轉化率 |
樣本起始量 |
|||||||||
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1 ng |
10 ng |
20 ng |
30 ng |
50 ng |
100 ng |
200 ng |
300 ng |
500 ng |
1000 ng |
|
|
20% |
5.000% |
0.500% |
0.250% |
0.168% |
0.100% |
0.050% |
0.025% |
0.017% |
0.010% |
0.005% |
|
30% |
3.400% |
0.340% |
0.170% |
0.113% |
0.068% |
0.034% |
0.017% |
0.011% |
0.007% |
0.003% |
|
50% |
2.000% |
0.200% |
0.100% |
0.067% |
0.040% |
0.020% |
0.010% |
0.007% |
0.004% |
0.002% |
|
100% |
1.000% |
0.100% |
0.050% |
0.033% |
0.020% |
0.010% |
0.005% |
0.003% |
0.002% |
0.001% |
當文庫轉化率為 50% 時，投入 400 ng 的樣本可檢出 0.005% 的突變；
② 增加突變位點數量
| 類別 | 產品名稱 | 規格 | 貨號 |
| μCaler? MRD | μCaler? MRD Solution (for Illumina?), 24 rxn | 24 rxn | 1100100 |
| UMI Adapter | NadPrep? UMI Adapter Kit Set A1 (with 10 nt Index), 24 rxn | # 1-12 | 1103111 |
| NadPrep? UMI Adapter Kit Set A2 (with 10 nt Index), 24 rxn | # 13-24 | 1103112 | |
| NadPrep? UMI Adapter Kit Set A3 (with 10 nt Index), 24 rxn | # 25-36 | 1103113 | |
| NadPrep? UMI Adapter Kit Set A4 (with 10 nt Index), 24 rxn | # 37-48 | 1103114 |
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